第358章 将军与公主（番外）（1 / 2）
(1)液体浅层培养：纯化后的原生质体悬浮于液体培养基中，取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口进行培养。
优点：操作简单，易于添加新鲜培养基。
缺点：原生质体容易发生粘连，难于定点观察。
(2)固体培养：也叫琼脂糖平板法或包埋培养法。将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂（主要是琼脂或低熔点琼脂糖）按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。
优点：便于观察，有利于减少有害释放物的影响
(3)固液双层培养法：在培养皿底部先铺一层固体培养基，待凝
固后再在其上进行液体浅层培养。
优点：固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收
原生质体融合（体细胞杂交）有哪些主要应用
（1）突破生殖障碍，克服有性杂交不亲和，创造新异核体细胞杂种
（2）转移优异农艺性状，创造新的种质材料
（3）选择性转移胞质基因和基因组，创造胞质杂种，研究质核互作和体细质基因遗传
原生质体融合有哪些方法
（1）自发融合：酶解细胞壁过程中，有些相邻的原生质体彼此融合形成同核体。来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高
（2）化学融合：NaNO3法、高pH-高钙法、聚乙二醇（PEG）诱导法、多聚化合物法
（3）电场诱导法（细胞电融合，主要是双向电泳法）：原生质体接触－质膜融合－圆球化－核融合
优点：避免化学物质的潜在毒害
融合率：与原生质体来源、体积、链的长度、脉冲持续时间及电压等因素有关。
激光诱导法
基于微流控芯片的细胞融合
（6）高通量细胞融合芯片
（7）其他细胞融合技术：如离子束细胞融合
技术
PEG诱导原生质体融合的可能机制是什么
简述几种主要原生质体融合方式的特点
（1）对称融合：是亲本原生质体在融合前未进行任何处理的一种融合方式。它综合双亲的全部性状。在导入有利性状的同时，也不可避免地带入了一些不利性状。
（2）非对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合的方式
原生质体融合的主要产物有哪些，各有什么作用
（1）对称杂种：指杂种中具有融合双亲全部的核遗传物质
（2）非对称杂种：指双亲或其中一方的核遗传物质出现了丢失
（3）胞质杂种：非对称杂种的一种，融合一方的核物质完全丢失，并且具有双方的细胞质遗传物质
异质杂种：胞质杂种的一种。指杂种的细胞核来源于一方，而细胞质来自于另一方
体细胞杂种的筛选和鉴定方法有哪些，哪一种最有效
（1）形态学鉴定：杂种在形态上往往介于双亲之间，包括株型、叶形、花器官等
（2）细胞学鉴定
染色体观察：染色体数目是双亲之和，或少1至几条染色体；细胞融合可以创造非整
倍体、代换系、染色体片段置换系等材料
流式细胞仪倍性分析：利用细胞倍性检测仪可以粗略地分析杂种细胞的倍性，一般与
双亲对照分析，测出的杂种的DNA含量基本是双亲之和。
（3）分子标记鉴定：最有效的检测手段，能检测出遗传物质的细小重组
（4）荧光原位杂交（FISH）鉴定：鉴定异源染色体的重组情况，将重组片段定位在染色体上。
（5）蛋白质电泳分析：从基因表达产物判断真假杂种，一般应有双亲作对照，可以对多种蛋白作分析
最有效的是：分子标记鉴定
II类(型)限制性核酸内切酶有何特点？
（1）能够识别特异性的DNA识别位点，这种识别位点通常是具有双链回文对称的结构。
（2）切割后形成的双链DNA分子能够彼此互补并能够重新连接。
（3）切割和修饰功能由2种不同的酶催化所完成。
（4）不需要ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）作为活性辅助因子。
2、比较质粒载体、λ噬菌体载体和粘粒（Cosmid）载体的特点。
质粒载体：（1）自主复制（2）质粒DNA的结合性
λ噬菌体载体：（1）λ噬菌体载体是一种可在体外包装的细菌病毒，可高效感染大肠杆菌（2）基因组为长度约为50kb的双链DNA分子（3）基因组DNA呈线性，其两端的5’末端带有12个碱基的互补单链（粘性末端，cos位点）（4）溶源状态：整合到大肠杆菌染色体，随之复制（5）溶菌状态：进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状DNA分子，并随宿主细胞复制，经过40～45min的生长循环，释放出约100个感染性噬菌体颗粒，裂解大肠杆菌完成自我包装。
粘粒载体：（1）具有λ噬菌体的特性（cos位点）：被包装后能高效转化E.coli（2）具有质粒载体的特性：自主复制，带有抗性标记，易于选择阳性克隆（3）高容量的克隆能力：可载高达45kb外源DNA（4）因不含λ的基因，故不会裂解（5）便于定向克隆
何为人工染色体载体？
人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体体系。
酵母人工染色体（YAC)
①存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段；
部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排；
难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构；
操作时容易发生染色体机械切割；
转化效率低。
细菌人工染色体（BAC）
易于用电击法转化E.coli（转化效率比转化酵母高10-100倍）；
超螺旋环状载体，易于操作；
F质粒本身所带的基因控制了质粒的复制；
很少发生体内重排。
（3）其它类型的人工染色体（PAC和TAC）
－P1人工染色体(P1ArtificialChromosome，PAC）
－植物可转基因人工染色体
常用的基因克隆方法有哪几类？各有什么特点？实际应用中有什么要求？
以已知序列为基础的基因克隆方法
以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法
以人工突变体为基础的基因克隆方法
以表达差异为基础的基因克隆方法
利用生物大分子之间相互作用的基因克隆方法。